如何減少柱外體積

更新時間：2022-09-06 點擊次數(shù)：1247

柱外體積（ECV）是指色譜系統(tǒng)從進樣器到檢測器這段管路除去色譜柱的總體積。大部分新的高效液相色譜系統(tǒng)都經(jīng)過了優(yōu)化，因此，可以使用高效的核殼顆粒（SPP）色譜柱，例如HALO。

現(xiàn)在讓我們簡單概述一下高效液相色譜系統(tǒng)。一個典型的HPLC系統(tǒng)由脫氣機、泵、自動進樣器、柱溫箱和檢測器。我們可以仔細看一下里面。

柱外體積通常來自進樣器，包括進樣器本身、連接進樣器與色譜柱的管路以及連接色譜柱與檢測器的管路、檢測器流通池、熱交換器以及各個連接配件所產(chǎn)生的任何體積。

但是有很多舊的色譜儀仍在使用。舊的色譜儀使用顆粒更大、長度更長的色譜柱，因此進樣器和管路的柱外體積對分離度和峰寬的影響比較小。在切換到更短的SPP色譜柱時，需要減少柱外體積，以避免峰值展寬，從而降低分離度以及定量結(jié)果的準(zhǔn)確度。

為了使色譜柱獲得良好的性能，應(yīng)該盡量減少柱外體積，以獲得色譜柱的最佳分離。通常，需要將柱外體積降至總峰值體積的一半以下，以獲得色譜柱最大分離效果。

如何使柱外體積達到最小？

第一，進樣體積。要確保把進樣體積控制在最小。

第二，樣品溶劑。盡量保持樣品的溶劑強度等于或小于初始流動相。如果必須使用*的有機溶劑作為樣品溶劑，那么要盡可能減少進樣量。

第三，柱前管路。需要確保您使用的是最小內(nèi)徑的管路。請注意，在樣品流路中使用幾種不同內(nèi)徑的管路可能會導(dǎo)致額外的擴散。對于梯度分離，通常可以忽略柱前管路對柱外體積的影響，但是，這個體積會對梯度延遲體積有影響。

第四，熱交換器體積。有些儀器有不同體積的熱交換器可供選擇。當(dāng)使用高柱溫時，這有助于使流動相與色譜柱之間的溫度相匹配。您需要使用與流速一致的最小體積的熱交換器，特別是對于2.1mm內(nèi)徑色譜柱。

第五，柱后管路。需要確保您使用的是最小內(nèi)徑的管路。請注意，在樣品流路中使用幾種不同內(nèi)徑的管路可能會導(dǎo)致額外的擴散。對于20-50mm 2.1mm內(nèi)徑的色譜柱，75或100μm內(nèi)徑的管路可能會提供更好的結(jié)果，但是這會產(chǎn)生更高背壓。

第六，流通池體積。對于2.1mm和3mm內(nèi)徑的色譜柱，通常使用1-5μl的流通池。更大的流通池通常用于4.6mm內(nèi)徑更長的色譜柱。

示例

讓我們來看一個例子。下圖展示了2μm 3.0×150mm HALO色譜柱在標(biāo)準(zhǔn)HPLC系統(tǒng)和UHPLC系統(tǒng)的等度分離性能對比。本例中，標(biāo)準(zhǔn)HPLC的柱外體積是64μl，UHPLC的柱外體積是16μl。在標(biāo)準(zhǔn)HPLC中，超快速的HALO色譜柱分析時間略長，且由于峰展寬，塔板數(shù)更低。此外，分離度比HALO色譜柱預(yù)計的要低。在轉(zhuǎn)移至具有更低柱外體積的UHPLC時，HALO色譜柱提供了更快速更高分離度的分離。

常規(guī)HPLC儀器的優(yōu)化

如果您沒有UHPLC儀器，不用擔(dān)心。您可以通過以下幾個方面來優(yōu)化您的系統(tǒng)以獲得更高的性能。

當(dāng)在常規(guī)的HPLC儀器上使用高效的SPP色譜柱（如HALO）時，我們建議您按照以下幾個步驟進行系統(tǒng)優(yōu)化。先從簡單、便宜的優(yōu)化開始，然后根據(jù)需要再進行更復(fù)雜和更昂貴的優(yōu)化。一旦您取得了可以接受的結(jié)果，您可以選擇放棄后續(xù)的優(yōu)化。

第一，減少檢測器的響應(yīng)時間，提高數(shù)據(jù)采集頻率。將檢測器響應(yīng)時間設(shè)置為小于0.1秒，并且數(shù)據(jù)采集頻率大于20Hz。例如，在這個色譜疊加圖中，您可以清楚地看到，隨著數(shù)據(jù)采集頻率的提高，塔板數(shù)也從11000增加到38000。

第二，將進樣體積減少到最小，并確保能達到可接受的峰值響應(yīng)。

第三，確保樣品溶劑強度比流動相弱。如果這不能滿足，那么需要對您的進樣體積有所限制。如果是梯度分離，那么您能夠注入比等度分離更多的樣品。然而，保持樣品溶劑強度小于初始流動相的強度仍然是重要的。

第四，使用體積更小，長度更短的管路。

第五，使用更小的流通池。

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